ChIRP-Mass檢測和ChIRP-WB驗證技術服務

ChIRP -Mass和ChIRP-WB應用場景：

ChIRP-Mass：用于構建目的RNA的蛋白互作組數據，或用于不同遺傳背景/實驗條件下的互作組差異。

ChIRP-WB：用于驗證目的RNA和候選蛋白的相互作用關系，或用于不同遺傳背景/實驗條件下的互作變化。

ChIRP-Mass是一種檢測細胞內RNA/蛋白互作組的高通量技術。該技術通過聯(lián)合探針Pulldown共沉淀技術和質譜檢測技術，對目的RNA在特定細胞/組織內的互作蛋白，進行系統(tǒng)的檢測和分析。該技術適用于目的RNA在特定細胞/組織中的蛋白互作組數據檢測，或用于不同遺傳背景/實驗條件下的互作組差異研究。因此，該技術是研究細胞內RNA互作調控網絡的常規(guī)前置技術。

ChIRP-WB是一種檢測細胞內RNA/蛋白互作的靶向驗證技術。通過聯(lián)合探針Pulldown共沉淀和Western Blot檢測技術，對目的RNA在特定細胞/組織內候選作用蛋白的互作關系進行驗證，明確RNA/候選蛋白的相互作用關系。該技術適用于目的RNA在特定細胞/組織中的蛋白互作檢測驗證，或用于不同遺傳背景/實驗條件下的互作差異研究。因此，該技術是研究細胞內RNA/蛋白互作調控網絡的常規(guī)檢測技術。

ChIRP -Mass和ChIRP-WB技術價值：

（1）RNA/蛋白相互作用數據是機制研究的重要基礎內容，體現機制研究的嚴謹性，能明顯提升臨床基礎類研究文章的檔次。

（2）細胞內RNA/蛋白互作處于動態(tài)變化過程，在不同條件下可發(fā)生動態(tài)變化，RNA動態(tài)互作組檢測，是RNA互作機制的亮點。

（3）RNA/蛋白互作，闡明復雜的互作調控機制，是RNA調控網絡的明珠，增加機制研究的深度，為靶點轉化提供關鍵切入點。

ChIRP -Mass和ChIRP-WB檢測方案：

客觀結果說明：乙方承諾提供的實驗數據真實可靠，且在同等實驗條件下的實驗數據趨勢可被重復。

進一步驗證方案：ChIRP-WB驗證的互作蛋白，建議再次通過RIP-qPCR進行反向互作驗證，避免假陽性數據，提高機制研究的嚴謹性。

ChIRP -Mass和ChIRP-WB檢測要點：

（1）實驗設計：盡量進行實驗組別設計和生物學重復檢測，提高后續(xù)驗證的陽性率。常規(guī)過表達單組（Target Probe vs 對照LacZ Probe）；動態(tài)互作組學（實驗組Target Probe vs 實驗組對照Target Probe）。根據實驗目的設計適當的生物學重復。如果后續(xù)以ChIRP-Mass數據進行互作組標準分析，則需要3-4組生物學重復；如果后續(xù)以尋找關鍵互作蛋白，進行深入的機制研究，則建議1-2次生物學重復。經驗顯示單次重復假陽性率達90%。

（2）RNA表達和細胞量：細胞用量要求大(2E7細胞量），建議不少于5E7（金標準：320g離心細胞量50μL，保障項目用量）。本底低表達RNA（內參△CT>12），建議使用過表達組進行檢測。

（3）qPCR和銀染質控：ChIRP探針覆蓋RNA，Pulldown檢測能夠成功下拉目的RNA，通過RT-qPCR檢測目的RNA有效富集。ChIRP產物考染/銀染質控。

（4）ChIRP送樣建議：IP質譜后需用PBS清洗去除NP40等去垢劑，不建議對蛋白進行洗脫處理送樣，避免丟失互作蛋白信息。

（5）互作蛋白篩選和驗證：數據分析以非標定量信號強度（LFQ intensity和FC>10）作為強陽篩選，以文獻查閱，功能匹配，批量ChIRP-WB驗證，提高驗證成功率。理想ChIRP-MS結果的蛋白定量都到超過1000種蛋白。其中絕大部分蛋白為非特異結合或背景蛋白。以目的蛋白的富集信號強度和差異倍數作為參考（相對強信號和差異），分析實驗組中明顯定量較高且差異較大的蛋白，作為重要候選蛋白。同時對重要候選蛋白進行STRING互作分析、文獻分析和目的蛋白功能匹配分析，選擇更優(yōu)的4-5個蛋白進行ChIRP-WB驗證，提高ChIRP-WB成功率。

ChIRP -Mass和ChIRP-WB優(yōu)劣勢：

優(yōu)勢：高通量獲得目的RNA的專屬蛋白互作庫，獲取目的RNA的互作蛋白機制分子。

劣勢：ChIRP的蛋白庫魚龍混雜，包含目的蛋白的直接/間接互作蛋白，非特異結合，殘留蛋白。常規(guī)理想IP-Mass項目可鑒定到1000-2000個蛋白，其中絕大部分是非特異性結合及清洗殘留的背景蛋白，導致ChIRP-Mass假陽性高，ChIRP-WB驗證成功率低，導致研發(fā)進展反復跌宕，時間和經費成本占用較大，嚴重影響士氣。其次，項目受限于蛋白表達量和IP抗體有效性，達到理想狀態(tài)的ChIRP-Mass較難，同時分析門檻較高。因此，成功實施該項目，比較依賴成熟和有分析經驗的團隊。建議整包交給專業(yè)的服務商開展檢測。

ChIRP -Mass和ChIRP-WB應用案例：   

ChIRP-Mass互作組驗證，即在互作組分析篩選的基礎上，進一步利用ChIRP-WB技術對感興趣分子進行靶向檢測，更加精細，也是互作組驗證的必由之路。成功驗證上岸的基礎是理想的互作組數據庫和豐富的分析經驗，方能事半功倍。廣州基云生物，在IP互作組檢測和關鍵機制分子篩選驗證領域，具有豐富的經驗，助力您的互作機制研究。歡迎垂詢合作，咨詢電話：王經理 13533661243（微信同號）。