CoIP-Mass檢測和CoIP-WB驗(yàn)證技術(shù)服務(wù)

CoIP-Mass應(yīng)用場景：

CoIP-Mass：用于構(gòu)建目的蛋白的蛋白互作組數(shù)據(jù)，或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作組差異。

CoIP-WB：用于驗(yàn)證目的蛋白和候選蛋白的相互作用關(guān)系，或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作變化。

CoIP-Mass是一種檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白互作組的套餐技術(shù)。該技術(shù)通過聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和質(zhì)譜檢測技術(shù)，對目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的互作蛋白，進(jìn)行系統(tǒng)的檢測和分析。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白互作組數(shù)據(jù)檢測，或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作組差異研究。因此，該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)前置技術(shù)。

CoIP-WB是一種檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白互作的驗(yàn)證技術(shù)。該技術(shù)通過聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和Western Blot蛋白檢測技術(shù)，對目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的互作關(guān)系進(jìn)行探究，明確蛋白直接的相互作用關(guān)系。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白互作檢測驗(yàn)證，或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作差異研究。因此，該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)檢測技術(shù)。

CoIP-Mass和CoIP-WB技術(shù)價(jià)值：

（1）蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)是機(jī)制研究的重要基礎(chǔ)內(nèi)容，體現(xiàn)機(jī)制研究的嚴(yán)謹(jǐn)性，能明顯提高臨床基礎(chǔ)類研究文章的檔次。

（2）細(xì)胞內(nèi)蛋白互作處于動(dòng)態(tài)變化過程，在不同條件下可發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，蛋白動(dòng)態(tài)互作組檢測，是蛋白互作機(jī)制的亮點(diǎn)。

（3）蛋白互作，往往是結(jié)構(gòu)域或部分關(guān)鍵區(qū)段的互作，可通過蛋白區(qū)段拆分，進(jìn)一步明確互作的結(jié)構(gòu)域，提升機(jī)制研究的高度，為靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化提供關(guān)鍵切入點(diǎn)。

CoIP-Mass和CoIP-WB檢測方案：

客觀結(jié)果說明：乙方承諾提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，且在同等實(shí)驗(yàn)條件下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)趨勢可被重復(fù)。

CoIP-Mass和CoIP-WB檢測要點(diǎn)：

（1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)：盡量進(jìn)行試驗(yàn)組別設(shè)計(jì)和進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)檢測，提高后續(xù)驗(yàn)證的陽性率。常規(guī)過表達(dá)單組（Ab IP vs IgG IP）；動(dòng)態(tài)互作組學(xué)（實(shí)驗(yàn)組vs對照組vs Ig組）。根據(jù)目的設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)重復(fù)。如果后續(xù)以CoIP-Mass數(shù)據(jù)進(jìn)行互作組標(biāo)準(zhǔn)分析，則需要3-4組生物學(xué)重復(fù)；如果后續(xù)以尋找關(guān)鍵互作蛋白，進(jìn)行機(jī)制深入研究，則建議1-2次生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)驗(yàn)顯示單次重復(fù)假陽性率90%。

（2）蛋白表達(dá)和細(xì)胞量：細(xì)胞用量要求大(2-10e7細(xì)胞量），建議不少于5e7（金標(biāo)準(zhǔn)：320g離心細(xì)胞量50μl，保障項(xiàng)目用量）。低表達(dá)蛋白，建議使用過表達(dá)組進(jìn)行檢測。蛋白表達(dá)可根據(jù)WB結(jié)果或初步根據(jù)數(shù)據(jù)庫判定（Proteomics DB，https://www.proteomicsdb.org；Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org/）。

（3）抗體關(guān)鍵質(zhì)控：抗體特異性和親和效價(jià)要求高，盡量采用標(biāo)簽抗體或經(jīng)過CoIP效果驗(yàn)證的抗體?？贵w質(zhì)量參差不齊（WB能檢測到預(yù)期條帶不到1/2，能檢測到良好結(jié)果的不到1/4）和存在非特異性結(jié)合（幾乎所有的抗體都存在非特異結(jié)合，部分非特異結(jié)合條帶遠(yuǎn)大于目的條帶），CoIP-MS需做WB和CoIP-WB質(zhì)控。初次和檢測CoIP都需要做WB質(zhì)控。正式CoIP可同時(shí)增加考染/銀染質(zhì)控?？贵w可參考數(shù)據(jù)庫（Validated Antibody DB, https://www.labome.com/index.html)。

（4）IP送樣建議：IP質(zhì)譜后需用PBS清洗去除NP40等去垢劑，不建議對蛋白進(jìn)行洗脫處理送樣，避免丟失互作蛋白信息。

（5）互作蛋白篩選和驗(yàn)證：數(shù)據(jù)分析以非標(biāo)定量信號強(qiáng)度（LFQ intensity和FC>10）作為強(qiáng)陽篩選，以文獻(xiàn)查閱，功能匹配，批量CoIP-WB驗(yàn)證，提高驗(yàn)證成功率。理想CoIP-MS結(jié)果的蛋白定量都到超過1000種蛋白。其中絕大部分蛋白為非特異結(jié)合或背景蛋白。以目的蛋白的富集信號強(qiáng)度和差異倍數(shù)作為參考（相對強(qiáng)信號和差異），分析實(shí)驗(yàn)組中明顯定量較高且差異較大的蛋白，作為重要候選蛋白。同時(shí)對重要候選蛋白進(jìn)行STRING互作分析，文獻(xiàn)分析，目的蛋白功能匹配分析，選擇Top的4-5個(gè)蛋白進(jìn)行CoIP-WB驗(yàn)證，提高CoIP-WB成功率。

CoIP-Mass和CoIP-WB優(yōu)劣勢：

優(yōu)勢：高通量獲得目的蛋白的專屬蛋白互作庫。

劣勢：CoIP的蛋白庫魚龍混雜，包含目的蛋白的直接/間接互作蛋白，非特異結(jié)合，殘留蛋白。常規(guī)理想IP-Mass項(xiàng)目可鑒定到1000-2000個(gè)蛋白，其中絕大部分是非特異性結(jié)合及清洗殘留的背景蛋白，導(dǎo)致CoIP-Mass假陽性高，CoIP-WB驗(yàn)證成功率低，導(dǎo)致研發(fā)進(jìn)展反復(fù)跌宕，時(shí)間和經(jīng)費(fèi)成本占用較大，嚴(yán)重影響士氣。其次，項(xiàng)目受限于蛋白表達(dá)量和IP抗體有效性，達(dá)到理想狀態(tài)的CoIP-Mass較難，同時(shí)分析門檻較高。因此，該項(xiàng)目成功實(shí)施，比較依賴成熟和有分析經(jīng)驗(yàn)的團(tuán)隊(duì)。建議整包交給專業(yè)的服務(wù)商開展檢測。

CoIP-Mass和CoIP-WB應(yīng)用案例：

CoIP-Mass互作組驗(yàn)證，即在互作組分析篩選的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用CoIP-WB技術(shù)對感興趣分子進(jìn)行靶向檢測，更加精細(xì)，也是互作組驗(yàn)證的必由之路。驗(yàn)證成功上岸的基礎(chǔ)是理想的互作組數(shù)據(jù)庫和豐富的分析經(jīng)驗(yàn)，方能事半功倍。廣州基云生物，在IP互作組檢測和關(guān)鍵機(jī)制分子篩選驗(yàn)證領(lǐng)域，具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，您的互作機(jī)制研究。歡迎垂詢合作，咨詢電話：王經(jīng)理 13533661243（微信同號）。