鐵死亡是一種由大量脂質過氧化物積累所驅動的調節(jié)性細胞死亡方式，與腫LIU發(fā)病密切相關，其調控機制尚不清楚。因此，深入理解腫LIU細胞抵抗鐵死亡的分子機制，將為腫LIU治L 提供新策略。

2024年4月，武漢大學醫(yī)學研究院、教育部免疫與代謝前沿科學中心、中南醫(yī)院以及泰康生命醫(yī)學中心團隊在PNAS雜志上，發(fā)表“USP8-governed GPX4 homeostasis orchestrates ferroptosis and cancer immunotherapy”的研究成果。該研究揭示了USP8通過穩(wěn)定谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）來抵抗鐵死亡，并強調了靶向USP8作為一種潛在的治L 策略來促進鐵死亡，以增強AI癥免疫治L 。

圖形摘要：

Highlights如下：

1）USP8的特異性敲除導致小鼠過早死亡，并伴有結腸上皮結構紊亂和脂質過氧化跡象。

2）抑制USP8可以增加腫LIU細胞對鐵死亡的敏感性。改善PD-1/PD-L1阻斷抗體的治L 效果。

3）機制上，USP8與GPX4相互作用，并去除GPX4的多聚泛素化修飾，從而抑制蛋白酶體介導的GPX4蛋白降解，抑制鐵死亡，促進腫LIU進展。

表型相關性：

Usp8的特異性敲除導致小鼠壽命縮短，腸上皮細胞死亡增加和脂質過氧化跡象增多。

功能研究：

體外抑制USP8增加腫LIU細胞對鐵死亡的敏感性。USP8抑制劑聯(lián)合鐵死亡誘導劑能明顯抑制腫LIU生長并改善PD-1/PD-L1阻斷抗體的治L 效果。

機制研究：

前面的研究顯示USP8能抑制鐵死亡。為了進一步探索USP8介導鐵死亡調控的分子機制，檢測USP8是否可以調節(jié)鐵死亡通路中關鍵蛋白的表達。

（1）初步確定下游的蛋白分子

通過WB檢測鐵死亡相關蛋白，發(fā)現(xiàn)敲低明顯降低GPX4蛋白的表達（圖1a-b）,但不影響其RNA水平（圖1c）。同樣抑制劑亦能降低GPX4的蛋白水平（圖1d）。構建GPX4 WT及其酶促失活突變體U46S進行功能實驗，證實過表達GPX4 WT蛋白在抑制RSL3誘導的鐵死亡方面具有功能（圖1e）。放線菌酮(CHX)試驗表明，敲低USP8縮短GPX4蛋白的半衰期（圖1f）。表明USP8可能作為一種去泛素化酶在翻譯后水平調節(jié)GPX4的蛋白豐度。蛋白酶體介導的降解系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)是調控蛋白質穩(wěn)態(tài)的兩大系統(tǒng)。而實驗表明蛋白酶體抑制劑MG132挽救了敲減USP8介導的GPX4不穩(wěn)定，而溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1 (BafA1)和氯喹(CQ)則無此作用（圖1g），表明USP8介導的GPX4穩(wěn)態(tài)調節(jié)取決于蛋白酶體系統(tǒng)。

圖1 USP8影響GPX4蛋白的穩(wěn)定性（Ref. Fig 4）

（2）分子互作機制

第一步，確定與下游蛋白分子的互作關系

為了探索USP8與GPX4是否互作，進行內源Co-IP實驗和GST pulldown實驗，發(fā)現(xiàn)USP8與GPX4互作（圖2a-c）。

第二步，USP8與GPX4蛋白結合的具體的位置

為了探索USP8與GPX4蛋白結合的位置，針對USP8構建不同的突變體分別進行Co-IP實驗，發(fā)現(xiàn)USP8通過 aa1-313、aa715-1118區(qū)域與GPX4結合（圖2d-e）。

第三步，USP8如何影響GPX4蛋白的穩(wěn)定性

USP8是一個去泛素化酶。Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，USP8能降低GPX4的泛素化水平，而酶非活性突變體USP8-c786a則不能去除GPX4的泛素鏈，表明USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（圖2f）。

圖2 USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（Ref. Fig 4/S4）

第四步，確定USP8去除GPX4的Ub K48鏈泛素化

眾所周知，泛素分子可以通過其七個賴氨酸(K)殘基中的一個(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)連接形成不同的泛素鏈。基于此，Co-IP分析發(fā)現(xiàn)GPX4被K27和K48連接的泛素化修飾（圖3a）。另外，Co-IP分析顯示USP8過表達降低GPX4上K48連接的泛素化，而不影響K27連接的泛素化（圖3b），表明USP8主要去除GPX4上K48連接的泛素化。體外去泛素化試驗表明（注：Ub(K48O)(只有完整的Lys48殘基的Ub)），USP8過表達以去泛素酶活性依賴性方式去除GPX4上K48連接的泛素化（圖3c）。

第五步，確定USP8去除GPX4蛋白泛素化位點

之前的研究已報道K48、K125、K127、K135和K151是GPX4的潛在泛素化位點。構建不同的泛素化位點突變體進行Co-IP分析，發(fā)現(xiàn)GPX4 K48R、K125R、K127R和K151R突變體K48連接的泛素化減少（圖3d）。另外，USP8過表達降低GPX4 WT、K125R、K127R和K151R突變體的泛素化，但未能消除GPX4 K48R突變體的泛素化（圖3e）。表明USP8主要去除GPX4上K48殘基的泛素化。

綜上所述，這些結果表明USP8作為穩(wěn)定GPX4的關鍵上游調節(jié)因子，主要通過去除GPX4上K48連接的泛素化來防止其蛋白酶體介導的降解。

圖3 USP8去除GPX4上K48殘基的K48鏈泛素化（Ref. Fig4/S4）

結論：本研究在小鼠腸上皮細胞特異性敲除Usp8后，觀察到結腸結構改變，小鼠壽命縮短，伴隨著腸上皮細胞死亡增加和脂質過氧化跡象增多。功能上，Usp8雜合缺失小鼠可抑制結直腸腫LIU發(fā)生和發(fā)展，體外抑制USP8可以增加腫LIU細胞對鐵死亡的敏感性。機制上，USP8與GPX4發(fā)生相互作用，并去除GPX4的多聚泛素化修飾，從而抑制蛋白酶體介導的GPX4蛋白降解。此外，USP8抑制劑聯(lián)合鐵死亡誘導劑能夠改善PD-1/PD-L1阻斷抗體的治L 效果。這項研究揭示了USP8通過調節(jié)GPX4的穩(wěn)態(tài)從而在體內調控鐵死亡的機制，為AI癥治L 提供了新的治L 靶點。