簡牘：疾病靶點泛素修飾調(diào)控機制研究思路。

Step1：根據(jù)臨床需求和文獻，凝練臨床科學問題。

Step2：根據(jù)臨床科學問題，確定泛素修飾靶點。

Step3：明確修飾靶點的細胞動物模型功能

Step4：解析泛素修飾酶，修飾類型和位點、以及下游機制分子調(diào)控方式等。

該研究為病理提供新視角、為診療提供新策略。

正文：

互作機制研究是臨床基礎(chǔ)研究的難點，修飾互作機制研究是互作機制研究上的明珠。泛素化修飾機制研究，主要目標是深入理解泛素化過程如何精確調(diào)控蛋白質(zhì)的功能，以及這些調(diào)控如何影響細胞生理和病理過程。

在解讀泛素化修飾的研究文獻，同時結(jié)合泛素化修飾研究中的實踐經(jīng)驗，我們對醫(yī)學泛素修飾的研究思路進行提煉總結(jié)，嘗試從以下幾個方面進行梳理，供大家參考！

1. 泛素化修飾體系簡介

泛素化修飾是細胞內(nèi)一種高度保守且復雜的蛋白質(zhì)調(diào)控機制，通過泛素分子（76aa）的共價結(jié)合，調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、定位、活性及相互作用，進而影響細胞功能、信號轉(zhuǎn)導、細胞周期、免YI 反應、細胞凋亡等多種生物學過程。涉及的泛素修飾體系，如下：

泛素連接酶（E1、E2、E3）：其中E3連接酶是泛素修飾系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，人E3泛素連接酶大概有666個。Ubibrower2.0和UbiNet2.0數(shù)據(jù)庫中顯示的E3連接酶和底物互作對已高達4068對。

去泛素酶（DUB）：去除泛素修飾，人大概86個去泛素化酶。Ubibrower2.0和UbiNet2.0數(shù)據(jù)庫中顯示的DUB和底物互作對已有967對。

泛素修飾的類型：共7種泛素化修飾類型，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63修飾。在泛素修飾中，E3連接酶通過泛素蛋白不同位點的賴氨酸（K）殘基與底物蛋白結(jié)合，從而形成不同類型的泛素鏈，發(fā)揮不同的作用（表1）。

表1. 泛素修飾類型功效簡介

2. 疾病泛素修飾相關(guān)蛋白靶點的開發(fā)

提煉科學問題：根據(jù)臨床問題，廣FAN閱讀文獻，基于現(xiàn)有知識空白或臨床需求，明確研究目標，可以是特定疾病中關(guān)鍵蛋白的泛素化調(diào)控機制，或是泛素化修飾異常分子與疾病發(fā)生的發(fā)展的關(guān)系等。

疾病關(guān)鍵蛋白泛素化調(diào)控機制研究：結(jié)合生物信息學在線工具（UbPred和GPS-Uber??），預測目標蛋白的可能泛素化位點。同時使用質(zhì)譜定性檢測（如4D-Shotgun鑒定技術(shù)）對目標靶蛋白進行泛素化修飾的鑒定，確定具體的泛素化位點。

疾病異常的泛素修飾蛋白分子開發(fā)：利用高通量質(zhì)譜技術(shù)（如4D泛素化修飾組學技術(shù)），鑒定疾病相關(guān)的泛素化修飾蛋白。

3. 疾病靶蛋白泛素化修飾的驗證

靶蛋白疾病功能驗證：利用siRNA/shRNA敲減技術(shù)，過表達等技術(shù)，驗證靶蛋白與疾病的關(guān)系。

CoIP-WB檢測泛素化修飾：利用特異性抗體對修飾蛋白進行IP實驗，使用泛素化抗體WB檢測靶蛋白的泛素化水平。

4. 泛素連接酶與去泛素化酶的鑒定

CoIP-Mass檢測或HuProt蛋白組芯片檢測技術(shù)：篩選與靶蛋白相互作用的泛素連接酶（E3）或去泛素化酶（DUBs）。同時結(jié)合在線預測數(shù)據(jù)庫（UbiNet2.0和Ubibrower2.0）分析，快速鎖定修飾酶。

CoIP-WB或Pulldown-WB技術(shù)：檢測與靶蛋白相互作用的修飾酶。進一步通過雙向CoIP結(jié)構(gòu)域截斷體互作驗證，明確修飾酶和靶蛋白結(jié)合的功能結(jié)構(gòu)域。

細胞遺傳驗證技術(shù)：利用siRNA/shRNA敲減、過表達等技術(shù)構(gòu)建修飾酶細胞遺傳模型，觀察靶蛋白泛素化水平的變化。

5. 泛素修飾類型與靶蛋白修飾位點的鑒定

使用HA-Ub-WT/KO泛素修飾系統(tǒng)檢測修飾類型：使用HA-Ub-WT和HA-Ub-KO（K6，K11，K27，K29，K33，K48和K63）載體，分別與泛素連接酶（E3）和修飾底物共轉(zhuǎn)染細胞，通過CoIP-WB檢測底物泛素化水平，明確泛素連接酶對修飾底物的泛素修飾類型?；蛟俅问褂?/span>HA-Ub-WT（K6R，K11R，K27R，K29R，K33R，K48R和K63R）載體，分別與泛素連接酶（E3）和修飾底物共轉(zhuǎn)染細胞，通過CoIP-WB檢測底物泛素化水平，再次明確泛素連接酶對修飾底物的泛素修飾類型。

使用靶蛋白修飾位點突變鑒定修飾位點：結(jié)合生物信息學在線工具（UbPred和GPS-Uber），預測可能的泛素化位點，構(gòu)建靶蛋白的位點突變體，與HA-Ub-WT質(zhì)粒和E3連接酶共轉(zhuǎn)染細胞，通過CoIP-WB檢測底物泛素化水平，明確修飾底物的關(guān)鍵修飾位點。

靶蛋白修飾突變體構(gòu)建驗證：構(gòu)建靶蛋白的泛素化位點突變體，通過比較野生型與突變體的功能差異，驗證泛素化位點的功能。

6. 靶蛋白泛素修飾的功能與機制解析

信號通路分析：利用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組和4D-DIA蛋白組等技術(shù)，分析泛素化修飾如何影響靶蛋白參與的信號通路。

CoIP-Mass檢測或HuProt蛋白組芯片檢測技術(shù)：篩選與靶蛋白相互作用的關(guān)鍵機制分子。

CoIP-WB檢測和功能驗證：不同泛素修飾狀態(tài)下，靶蛋白和下游機制分子的互作變化，以及這些變化對機制分子的功能影響。

總結(jié)：通過以上機制探索研究思路，可以深入地揭示泛素化修飾在細胞生理和病理過程中的作用機制，為疾病診療提供新的靶點和策略。如您有泛素修飾方面的科研問題，歡迎隨時來撩！