膠質(zhì)LIU是最常見的中SHU神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫LIU，預(yù)后差，中位生存期低。膠質(zhì)母細(xì)胞LIU（GBM）約占膠質(zhì)LIU的50%，對于復(fù)發(fā)性GBM目前尚無有用的治LIAO選擇。因此，迫切需要進(jìn)一步了解復(fù)發(fā)性膠質(zhì)LIU的分子BING理，尋找新的YAO物靶點(diǎn)，開發(fā)新的膠質(zhì)LIU治LIAO方法。

2024年3月，中南大學(xué)湘雅hospital研究團(tuán)隊(duì)在Signal Transduction and Targeted Therapy（簡稱STTT）雜志上，發(fā)表“Suppression of ITPKB degradation by Trim25 confers TMZ resistance in glioblastoma through ROS homeostasis”的研究成果，該研究揭示ITPKB可能是TMZ耐YAO性膠質(zhì)LIU的潛在診LIAO靶點(diǎn)。

分子備注

ITPKB：Inositol-trisphosphate 3-kinase B

TRIM25：E3 ubiquitin/ISG15 ligase TRIM25

圖形摘要：

Highlights如下：

1）臨床相關(guān)性：復(fù)發(fā)組中ITPKB的表達(dá)高于原發(fā)組，且與膠質(zhì)LIU患者的預(yù)后不良相關(guān)。

2）耐YAO功能：耐YAO細(xì)胞中，敲減或抑ZHI激酶ITPKB能夠恢FU細(xì)胞對TMZ的敏感性。ITPKB通過ROS穩(wěn)態(tài)參與TMZ敏感性。

3）分子機(jī)制：調(diào)控上游Trim25 在 S100 位點(diǎn)的磷酸修飾水平降低，從而促使ITPKB 泛素化水平的下調(diào)，促進(jìn)ITPKB 蛋白穩(wěn)定性積累，從而降低 ROS 水平。

臨床相關(guān)性：

ITPKB在復(fù)發(fā)組中明顯上調(diào)，與膠質(zhì)LIU患者的預(yù)后不良相關(guān)。

功能研究：

耐YAO細(xì)胞中，敲減激酶ITPKB能夠恢FU細(xì)胞對TMZ的敏感性。ITPKB敲低或使用ITPKB抑ZHI劑GNF362聯(lián)合TMZ治LIAO，都明顯降低腫LIU生長和腫LIU重量。

機(jī)制研究：

（一）信號通量機(jī)制

結(jié)合Linkedomics數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)組學(xué)分析和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，表明ITPKB對TMZ耐YAO膠質(zhì)LIU細(xì)胞化療反應(yīng)的影響依賴于ROS的穩(wěn)態(tài)。

（二）分子互作機(jī)制

第一步：分子互作蛋白篩選

探索1：調(diào)控水平確認(rèn)。研究發(fā)現(xiàn)ITPKB蛋白（不是mRNA水平）在復(fù)發(fā)性組ZHI和TMZ耐YAO細(xì)胞中明顯上調(diào)（圖1a-b），表明ITPKB蛋白的升高是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的結(jié)果。

探索2：互作泛素酶篩選。CoIP-MS分析發(fā)現(xiàn)泛素連接酶Trim25可能為候選互作蛋白（圖1c）。調(diào)控蛋白積累的互作蛋白，推薦泛素連接酶，讀者朋友們可以借鑒。

驗(yàn)證1：CoIP驗(yàn)證。內(nèi)源anti-Trim25 Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Trim25與ITPKB的結(jié)合，與敏感細(xì)胞相比，在耐YAO細(xì)胞中相互作用更弱（圖1d）。同時內(nèi)源anti-Trim25 Co-IP實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)敏感細(xì)胞經(jīng)TMZ處理后，ITPKB與Trim25結(jié)合能力下降（圖1e）。外源Co-IP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)TMZ處理減少Trim25與ITPKB相互作用（圖1f）。這是環(huán)境條件下互作機(jī)制研究的既定動作，讀者朋友們可以參考。

驗(yàn)證2：關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域互作驗(yàn)證。ITPKB蛋白是一種激酶，TRIM25和IPTKB的互作是否通過調(diào)控激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)揮功能，需要進(jìn)一步探究。作者通過構(gòu)建系列ITPKB截短突變體，進(jìn)行Co-IP檢測分析，結(jié)果表明ITPKB激酶結(jié)構(gòu)域是其與Trim25結(jié)合所必需的(圖1g-h)。表明Trim25與ITPKB的這種相互作用，是通過ITPKB的激酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行相互作用的。這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了TRIM25可能是調(diào)控IPTKB蛋白積累的關(guān)鍵上游調(diào)控蛋白。

圖1 Trim25是ITPKB結(jié)合蛋白（Ref. Fig 4）

第二步：分子互作蛋白調(diào)控目的蛋白IPTKB的分子機(jī)制

TRIM25是一種泛素連接酶，是否參與調(diào)控ITPKB蛋白穩(wěn)定性積累？

證據(jù)1：研究人員發(fā)現(xiàn)敲低Trim25，明顯增加ITPKB蛋白積累；Trim25過表達(dá)則相反抑ZHI其積累（圖2a-b）。

證據(jù)2：加入蛋白酶體抑ZHI劑MG132后，Trim25過表達(dá)誘導(dǎo)的ITPKB水平降低效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)（圖2c），表明Trim25通過蛋白酶體途徑降低ITPKB的穩(wěn)定性。

證據(jù)3：采用放線菌酮(CHX)追逐實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Trim25敲低增加ITPKB蛋白的半衰期，Trim25過表達(dá)則相反（圖2d-e）。

證據(jù)4：耐YAO細(xì)胞內(nèi)源Co-IP分析顯示Trim25敲低明顯降低ITPKB的多泛素化（圖2f）。外源Co-IP分析，Trim25過表達(dá)增加ITPKB多泛素化（圖2g）。

證據(jù)5：泛素化修飾類型研究。研究人員分別用Ub-K48、Ub-K63進(jìn)行Co-IP泛素化分析，表明ITPKB被Ub-K48普遍泛素化（圖2h）；用Ub-K48、Ub-K48R進(jìn)行Co-IP泛素化分析，表明Ub-K48R組的ITPKB多泛素化被去除（圖2i）。表明Trim25介導(dǎo)ITPKB的K48鏈泛素化。

證據(jù)6：ITPKB泛素化修飾位點(diǎn)確認(rèn)。網(wǎng)站預(yù)測ITPKB的K793和K818可能是Trim25結(jié)合域附近的潛在泛素化位點(diǎn)。構(gòu)建ITPKB的K793R、K818R和2KR突變體，Co-IP分析單位點(diǎn)突變(K793R或K818R)對多泛素化沒有影響，兩個位點(diǎn)突變2KR去除ITPKB中K48鏈的多泛素化（圖2j-k）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也顯示ITPKB野生型(而不是2KR突變型)增加細(xì)胞的存活率和ROS的降低（圖2l-m）。

這些結(jié)果表明：TRIM25通過泛素修飾系統(tǒng)，參與ITPKB的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控。

 圖2 Trim25介導(dǎo)ITPKB K48鏈在K793和K818位點(diǎn)的泛素化（Ref. Fig5）

第三步：在環(huán)境條件（耐YAO）中，上游蛋白TRIM25的分子特征和調(diào)控機(jī)制

TRIM25在TMZ耐YAO中的分子狀態(tài)發(fā)生了什么變化，從而影響了IPTKB蛋白積累？

探索：TRIM25磷酸化位點(diǎn)發(fā)生變化。研究表明翻譯后修飾(如磷酸化)在調(diào)節(jié)Trim25活性中起重要作用。為了探究Trim25在初發(fā)和復(fù)發(fā)GBM中的功能差異的原因，通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Trim25的S100位點(diǎn)磷酸化在復(fù)發(fā)樣本中明顯降低（圖3a-b）。體外泛素化實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果顯示Trim25被ALP去磷酸化時，ITPKB泛素化明顯減少（圖3c）。表明Trim25中S100磷酸化水平的降低可能會干擾Trim25的E3連接酶活性，導(dǎo)致ITPKB的穩(wěn)定性增加。

驗(yàn)證：通過擬磷和去磷酸化方法，發(fā)現(xiàn)在Trim25的S100D擬磷突變中，Trim25與ITPKB結(jié)合增強(qiáng)；在Trim25的S100A去磷突變中，Trim25與ITPKB結(jié)合降低(圖3d)。與野生型Trim25相比，Trim25的S100D突變體增加了ITPKB的泛素化水平，而Trim25的S100A突變體降低ITPKB的泛素化水平(圖3e)。

這些結(jié)果表明：Trim25的S100位點(diǎn)磷酸化對于Trim25介導(dǎo)的ITPKB蛋白的泛素化是必需的。

 圖3 Trim25的S100磷酸化是ITPKB泛素化所必需的（Ref. Fig6）

結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)，ITPKB在復(fù)發(fā)組中明顯上調(diào)，與膠質(zhì)LIU患者的預(yù)后不良相關(guān)。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)顯示敲減ITPKB或使用ITPKB抑ZHI劑GNF362能恢FU細(xì)胞對TMZ的敏感性。機(jī)制上，Trim25在S100位點(diǎn)的磷酸化降低導(dǎo)致與ITPKB結(jié)合降低，降低ITPKB泛素化水平，進(jìn)而提高ITPKB的穩(wěn)定性，降低ROS的水平。該研究揭示一種新的TMZ耐YAO機(jī)制，并提出ITPKB可能是TMZ耐YAO性膠質(zhì)LIU的有前途治LIAO靶點(diǎn)。